Mise au point d’une méthode d’extraction et de purification des ARNm pour l’étude du métatranscriptome bactérien de graines de haricot en cours de développement, contaminées et non contaminées, par séquençage en RNA-Seq
| Titre | Mise au point d’une méthode d’extraction et de purification des ARNm pour l’étude du métatranscriptome bactérien de graines de haricot en cours de développement, contaminées et non contaminées, par séquençage en RNA-Seq |
| Type | Rapport de stage |
| Auteurs | Guérin Camille |
| Directeurs | Boureau Tristan |
| Année | 2016 |
| URL | http://dune.univ-angers.fr/fichiers/20135892/20163MABTV6632/fichier/6632F.pdf |
| Mots-clés | ARNr, Graine, haricot, Hybridation soustractive, Métatranscriptome, Microbiote, RNA-Seq |
| Résumé | Les graines sont le principal moyen de survie et de dissémination des plantes et nombreux micro-organismes, qui constituent le microbiote des semences et qui peuvent avoir un impact aussi bien bénéfique que néfaste ou nul sur la germination et/ou la croissance des plantes. Ainsi, mieux comprendre les mécanismes qui interviennent lors de la transmission à la semence pourrait permettre de développer, à terme, de nouvelles pratiques culturales ou de nouvelles méthodes de lutte contre les bactéries pathogènes transmises par les semences. Afin d’étudier le métatranscriptome de graines de haricot saines et contaminées en cours de développement, par une approche de séquençage en RNA-Seq, un protocole d’extraction et de purification des ARN bactériens a été mis en place. L’analyse des séquences des échantillons après macération, broyage et filtration a permis de montrer que ces étapes permettaient de caractériser le microbiote des graines mais n’étaient pas suffisantes pour purifier les ARNm bactériens avant séquençage. En effet, les ARNm bactériens sont 22 000 à 76 000 fois moins abondants que les ARN de haricot et/ou ribosomiques. Bien que le nombre de séquences soit insuffisant pour l’étude des fonctions du métatranscriptome, quelques protéines bactériennes, susceptibles d’être impliquées dans la transmission à la semence, ont été identifiées. En outre, l’étude de la diversité et de la richesse bactérienne chez les graines saines et contaminées a permis de montrer que le microbiote des graines était perturbé par la colonisation de Xff 7767-GFP. Enfin, afin d’enrichir les échantillons en ARNm bactériens avant séquençage, une stratégie de déplétion des ARNr par hybridation soustractive a été développée. Un cycle a permis la déplétion de 50 à 75 % des ARNr et plusieurs cycles pourraient être envisagés, mais la synthèse du double brin à partir des ADNsb générés par cette méthode constitue un nouveau verrou technique pour les séquencer sous forme d’ADNdb. Les échantillons pourraient donc être séquencés en simple brin ou des adaptateurs pourraient être ligués avant dénaturation pour fixer des amorces, à partir desquelles la synthèse du double brin pourrait être initiée. |
| Résumé en anglais | Seeds are the main survival and dissemination way of plants and lots of microorganisms. These microorganisms form the seed microbiota and are able to have a beneficial impact, as well as a negative or a null impact on germination and/or plant growth. Therefore understanding mechanisms involved in bacterial transmission to seeds could lead to the development of new agricultural practices or new control methods against seed-borne bacterial pathogens. In order to study the metatranscriptome of non-infected and infected developing seeds, according to a RNA-Seq sequencing approach, a protocol for bacterial RNA extraction and purification was set up. Thanks to sequence analysis of samples after maceration, grinding and filtration, the seed microbiota was characterized. However, these steps were not sufficient to purify bacterial mRNA before sequencing. Indeed, bacterial mRNA were 22 000 to 76 000 times less abundant than bean and/or ribosomic RNA. Although the sequence number was insufficient for the metatranscriptome functional study, a few bacterial proteins, likely to be involved in bacterial transmission to seeds, were identified. Furthermore, the study of the bacterial richness and the bacterial diversity of non-infected and infected developing seeds has shown that the seed microbiota was disrupted by Xff 7767-GFP colonization. Finally, in order to enrich samples in bacterial mRNA before sequencing, an rRNA depletion strategy was developed, according to a subtractive hybridization process. One cycle has led to the depletion of 50 to 75 % of the rRNA, therefore several cycles may be considered. However, dsDNA synthesis from ssDNA generated by this method represents a new technical obstacle for dsDNA sequencing. To solve this problem, ssDNA sequencing may be considered or adaptors may be fixed before the denaturation step to allow specific primers to initiate the double strand synthesis. |
| Langue de rédaction | Français |
| Nb pages | 38 |
| Diplôme | Master Biologie Végétale |
| Date de soutenance | 2016-09-16 |
| Editeur | Université Angers |
| Place Published | Angers |
| Entreprise | IRHS |
| Tuteur | Tristan Boureau |
| Libellé UFR | UFR de Sciences |